《菜用甘薯绿色高效栽培技术》 | 第三章 菜用甘薯健康种苗繁育技术 第二节 菜用甘薯脱毒生产技术

菜用甘薯茎尖收获期为4月中旬至10月下旬（保护地栽培可延长3月中旬至11月上旬），目前种植户一般均采用无性繁殖的方式达到保苗和扩繁的目标，在长期的无性繁殖过程中，通过薯块和秧苗传播的病毒会聚集，病毒积累随之增多，造成其产量和品质严重下降。另外由于交通日益便利，各地引种调种频繁，南病北移、北病南移现象严重，菜用甘薯种性退化严重。近几年，甘薯病毒病在我国甘薯主产区大面积暴发，一般可使甘薯产量降低30%~50%，严重时甚至绝产，对安全生产造成严重威胁。利用茎尖脱毒技术繁殖健康种苗是保证菜薯高效生产的关键。菜用甘薯脱毒原种快速繁育技术一般包括以下几个方面。

一、选择优良品种

根据不同的地域特点选择适合当地种植的菜薯品种。除了品种因素外，影响菜薯品质的其他因素主要是生长速度，生长速度越快，口感相对越好。品种的耐渍、耐肥、抗病虫能力，也是选择品种的重要评估因子。

二、脱毒技术

1.热处理法

热处理法的原理是，加热可以使组成病毒的蛋白质改变性状，且病毒和植物对热的忍耐力也不同，在植物可以忍受的温度范围内使病毒死亡，达到脱除病毒的目的。

2.茎尖分生组织培养

茎尖培养法又叫分生组织培养法。其原理是植物分生组织的生长速度大于病原菌的扩散速度，且病原菌在植物体内分布不均匀，所以一般分生组织中含少量或者不含病原菌，另外分生组织中不含维管束，病毒颗粒很难到达分生组织，目前这也是进行脱毒苗生产的主要方式。具体操作为：为降低实验材料污染率，需提前将种薯播种至花盆中，并置于37℃人工气候培养箱或室外中进行催芽；催芽一般需要提前30~60天开始。苗高20cm左右时，选取2cm左右茎段，剪去肉眼可见叶片，自来水冲洗30min，70%酒精浸泡10s，2%次氯酸钠溶液消毒处理20min，无菌水冲洗3遍。在超净工作台中体视显微镜下，剥离0.2~0.3mm的茎尖，接种到含有激素的MS培养基中。28℃、1600lx光照条件下16h/d，20天后茎尖开始形成愈伤组织，此时转入普通MS培养基上培养50~60天，待幼苗长出5~7片真叶时进行病毒检测。

3.病毒抑制剂法

病毒抑制剂法的原理是，在三磷酸状态下，病毒抑制剂会阻止病毒RNA帽子结构的形成。普遍利用的抗病毒抑制剂有5G二氢尿嘧啶（DHT），三氮唑核苷（病毒唑），放线菌素GD双乙酰G二氢G5G氮尿嘧啶（DAGDHT），碱性孔雀绿，环己酰胺等。这种方法和茎尖培养法一起使用，对于顽固的，利用单一方法无法去除的病原菌能够快速脱去，而且两者结合，优化实验条件，易于分化成苗，提高存活率。

三、病毒检测

由于甘薯病毒种类繁多，植株症状表现复杂，加强病毒检测是培育甘薯脱毒苗的重要措施，组培苗必须经过严格病毒检测，才能确认为无毒苗。病毒检测常用症状学诊断法、指示植物检测法、血清学检测和PCR检测四种方法。

1.症状学诊断法

症状学诊断法需全面观察组培苗长势长相，将长势弱，叶片黄化、黄脉和花叶等症状明显的带毒苗淘汰去除。

2.指示植物检测法

指示植物巴西牵牛（Ipomoea setosa）是一种旋花科植物，它能被大多数侵染甘薯的病毒侵染并在其叶片上表现出明显的系统性症状。指示植物检测法将生长可疑的茎尖苗嫁接在巴西牵牛上后查看症状。如有明脉、褪绿斑、花叶等症状，即为带毒苗，将其淘汰去除。具体操作如下：将待测试管苗温室培养长至4~5个节，将待检测甘薯植株切下3~4个节作接穗，去叶留顶叶，将底端削成楔形，另外以防虫网室中培育的具有1~2片真叶的巴西牵牛作砧木，在其子叶以下的茎（下胚轴）中部切一个长度与楔形长度相近的斜口，把接穗的楔形部分对斜口插入，用封口膜绑扎，置于防虫网室内，随后进行正常的田间管理。嫁接后10~20天，如果接穗带有病毒，巴西牵牛新生叶片上即可出现系统性明脉和褪绿斑等症状，记录发病情况。嫁接时每株牵牛上接一段接穗，每个株系嫁接3~5株巴西牵牛，如果其中有一株巴西牵牛叶片上出现病毒症状，则可认为该株系带有病毒，应全系剔除。如果所嫁接指示植物都未出现病毒病症状，应再取样重新嫁接一次，经两次嫁接，指示植物均未显症者，即可确定为无病毒苗，可进行扩繁生产。该方法灵敏度高，可有效地检测出SPFMV、SPLV和SPCSV等病毒，无需抗血清及贵重设备和生化试剂，方法简便易行，成本低，但所需时间较长，难以区分病毒种类。

3.血清学检测

利用血清学检测甘薯病毒最适宜的方法是NCMGELISA方法，该方法利用硝酸纤维素膜作载体免疫酶联反应技术，具有特异性强、方法简便、快速等特点，便于大量样本检测。用到的试剂包括：Tris、氯化钠（NaCl）、叠氮化钠（NaN3）、亚硫酸钠（Na2SO3）、脱脂奶粉、TritonXG100、氯化镁（MgCl22O）、抗血清、羊抗免IgG碱性磷酸酯酶结合物、氮蓝四唑（NBT）、5溴—4氯—3吲哚磷酸（BCIP）、N—N二甲基酰胺、硝酸纤维素膜等。

缓冲液配制如下：TBS缓冲液0.02mol/L，TrisBase4.84g，0.5mol/L氯化钠58.44g，质量分数为0.0001的叠氮化钠0.4g，溶解于1995ml蒸馏水中，并用氯化氢（HCl）调节pH值至7.5，蒸馏水定容至2000ml；提取缓冲液，亚硫酸钠（Na2SO3）1g加TPS缓冲液500ml；封闭缓冲液，脱脂奶粉2.4g，TritonXG1002.4ml加TPS缓冲液120ml；TGTBS缓冲液（洗涤用），0.5mlTweenG20，加TBS缓冲液1000ml；抗体缓冲液，脱脂奶粉4.8g，加TBS缓冲液240ml；AP缓冲液（基质），0.1mol/LTrisBase6.05g，0.1mol/L氯化钠2.92g，氯化镁0.51g，质量分数为0.0001叠氮化钠0.05g溶于450ml蒸馏水中，HCl调节pH值至9.5，定容至500ml；

NBT及BCIP原液的配制（NBT和BCIP均为剧毒物质，取用时须小心，戴手套），NBT原液，NBT40mg加体积分数为0.7的N—N二甲基酰胺1.2ml混匀，于4℃下避光保存（用深色瓶子或用铝箔包裹）；BCIP原液，BCIP20mg加体积分数为0.7的N—N二甲基酰胺1.2ml混匀，4℃下避光保存（用深色瓶子或用铝箔包裹）。

样品采集与提取，用塑料袋套住需检测的样品，用直径1cm的试管或金属笔套隔塑料袋从样品上压下直径为1cm的圆叶片留在袋中，取出多余的叶片，向袋子中加1ml抽提缓冲液，用棒轻轻碾压，把碎叶组织与缓冲液混匀，4℃下静置30~40min，取澄清汁液点样。点样时，将硝酸纤维素膜铺在滤纸上，用干净的灭菌移液管小心地吸取袋中上清液20~30μl，滴在膜上方格中，每加个样换一支移液管滴头，直至全部完成后，将膜转到另一张干净的滤纸上，待膜干后进行显色处理。

显色处理时，用封闭缓冲液30ml浸泡点样膜，振动孵育60min，弃去封闭液；用30ml抗体缓冲液与适量甘薯病毒抗血清混匀（具体量根据抗血清使用说明），将点样膜浸入孵育过夜。第2天弃去一抗缓冲液，用TGTBS缓冲液30ml振荡洗涤4次，每次3~5min。将点样膜转入加有酶标记的二抗缓冲液中，振荡孵育60min，弃去二抗缓冲液，用TGTBS缓冲液30ml振荡洗涤4次，每次3~5min，最后用AP液30ml洗涤1次。现配NBT/BCIP底物溶液，AP缓冲液100ml加入NBT原液300ml，边搅拌边滴加BCIP300μl混匀。

将点样膜放入25mlNBT/BCIP底物缓冲液中显色，振动孵育30~40min，终止反应。用蒸馏水洗膜3次，每次3min样点反应成蓝紫色的为阳性，表明该样品带有病毒，颜色越深，病毒含量越高。

4.PCR检测

PCR检测是目前生产上主要采取的检测手段，主要检测严重威胁甘薯生产的SPCSV、双生病毒、SPVD病毒，针对上述三种病毒的不同特性应采取不同的检测方法。

SPCSV是长线性病毒科（Closteroviridae），毛形病毒属（Crinivirus），是唯一侵染甘薯的长线性病毒，由粉虱以半持久方式传播，寄主范围主要是旋花科、茄科和苋科，SPCSV可使甘薯减产15%~88%。SPCSV的检测采用RTGPCR方法，具体步骤为，首先利用总RNA提取试剂盒，提取甘薯叶片中的总RNA，利用特异反向引物发转录合成cDNA第一条链，利用正向引物PCR扩增目的片段，引物序列和扩增方式参照乔奇等2012年发表在植物生理学报上的文章。

双生病毒是一种单链环状DNA病毒，分布范围广，在全球范围内危害日益猖獗，在非洲、地中海、东南亚、中南美洲及加勒比海地区流行成灾害，其寄主包括多种粮食作物（小麦、薯类等）、经济作物（棉花、烟草、番茄和大豆等），其蔓延速度快，在多种作物和杂草上都有双生病毒发生，且在我国由南向北蔓延加快。双生病毒可以导致甘薯减产11%~86%。双生病毒是一种DNA病毒，首先利用基因组提取试剂盒提取组织中的基因组DNA，以基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物及PCR反应条件参照乔奇等2012年发表在植物生理学报上的文章。

SPVD是甘薯复合病毒，由SPFMV和SPCSV协生共侵染引起，因此只要在样品中同时检测到二者，则认为感染了SPVD。感染SPVD的甘薯品种表现为叶片扭曲、畸形、叶片褪绿、明脉以及植株矮化等症状。SPVD开始主要发生在东非、西非和南美，对甘薯产量影响极大，严重时可造成90%以上的产量损失，甚至绝收，是甘薯最严重的病害之一，目前已成为影响我国疫区甘薯生产的主要障碍和甘薯产业发展的潜在威胁。针对主要靠粉虱传播的甘薯毁灭性病毒病SPVD，更换脱毒品种和甘薯苗期保护是疫区预防病害的重要措施。

SPFMV和SPCSV均为RNA病毒，采用RTGPCR方式进行检测，详细可参照乔奇等2012年发表在植物生理学报上的文章。

四、脱毒试管苗快速繁殖

脱毒试管苗可以在培养室内进行切段快速繁殖，也可以在防虫温室或网室内栽培，以苗繁苗。室内切段扩繁是将病毒检测确定无病毒的试管苗，在无菌条件下将5~7叶的脱毒苗按节切段，移入普通MS培养基中，28℃，1600lx光照条件下16h/d，经3~5天腋芽萌发，30天左右成苗，后期可不断切段增殖培养，繁殖系数为3n，繁殖速度以几何级数增长，一般品种，3个月内可繁殖大量的脱毒苗。

（作者：杨新笋 苏文瑾）